【前言简介】
KPC是许多国家中最流行的碳青霉烯酶之一。另一方面，D类OXA-48型碳青霉烯酶和变异体是临床实验室检测的最具挑战性的耐药性机制。特别是，OXA-163变体是一种难以识别的酶。事实上，尽管OXA-163比OXA-48显示出较弱的碳青霉烯酶活性，但它对广谱头孢菌素（ESC）的活性增加，这是快速鉴定的另一个挑战。快速识别这些碳青霉烯酶对于改善患者的治疗和控制这类抗生素耐药性在医院中的传播是最重要的。使用特定抑制剂组合的验证性表型试验已经存在，用于检测选定类型的碳青霉烯酶，包括A类（KPC）和B类（VIM，IMP，NDM）碳青霉烯酶；然而，这些测试很耗时，在抗菌药物敏感性测试结果后需要额外的一天。此外，表型比色法在某些情况下，表型比色法对检测低水平表达的碳青霉烯酶，如OXA-48和密切相关变体（所谓的“OXA-48-like”）和具有极低碳青霉烯酶活性的OXA-163亚家族不够敏感。目前，OXA-48或OXA-163的确诊依赖于分子分析和基因测序。这些测试费用昂贵，只能在专门的环境中由熟练的人员进行，因此限制了它们更广泛的使用。
【检测原理】
本试剂盒是基于胶体金纳米颗粒膜技术的即用型检测试剂盒，可用于检测肠杆菌科或NFGNB单个菌落分离物中的碳青霉烯酶。
对硝酸纤维素膜致敏：一种直接针对OXA-48碳青霉烯酶和其变体（除了OXA-163变体之外）一个表位的单克隆抗体、另一种直接针对OXA-48碳青霉烯酶和变体（包括OXA-163）另一个表位的单克隆抗体以及第三种直接针对KPC碳青霉烯酶一个表位的单克隆抗体。
三种不同的胶体金纳米颗粒共轭物在膜上干燥：一种直接针对OXA-48（+163）碳青霉烯酶第三表位的共轭物、一种直接针对KPC碳青霉烯酶第二表位的共轭物和一种用于验证检测条件的质控共轭物。
本试验目的在于检测琼脂培养皿上生长的肠杆菌科单一菌落分离物中的OXA-48样碳青霉烯酶、OXA-163样ESC’s和KPC碳青霉烯酶。
当含有重悬细菌的缓冲液与膜接触时，溶解的共轭物通过被动扩散与样本迁移，共轭物和样本材料都接触到第一个吸附在硝酸纤维素膜上的抗KPC抗体。若样本中含有KPC碳青霉烯酶，则共轭物-KPC复合物将与第一条吸附有抗KPC抗体的线（底部）结合。共轭物和样本材料继续通过被动扩散迁移，二者都接触到吸附在硝酸纤维素膜第二条抗OXA-48抗体线和第三条抗OXA-163（+48）抗体线。若样本中含有OXA-48碳青霉烯酶，则共轭物-OXA-48复合物将继续与吸附在硝酸纤维素膜上的抗OXA-48抗体结合。若样本中含有OXA-163碳青霉烯酶，则共轭物-OXA-163复合物将继续与吸附在硝酸纤维素膜上第三条线上的抗OXA-163（+48）抗体结合*。溶液继续迁移达到第四条质控线并与质控共轭物结合，生成一条红线。15分钟内根据检测卡上的红线读取结果。
*：第二种共轭物是直接针对所有OXA-163和所有OXA-48变体的，若样本中含有很高数量的OXA-48，则第二条线（检测卡上标记为48）将是强阳性的，且第三条线（检测卡上标记为163）上可能会出现微弱的信号，因为一部分OXA-48可能不会被第二条线捕获。
【试剂盒组成成分】
1）RESIST-3 O.O.K.检测卡： 20x，检测卡，单独包装
2）LY-A缓冲液： 15mL，含Tris、叠氮化钠（＜0.1%）和洗涤剂，pH7.5的盐溶液
3）带滴管的半刚性一次性收集管： 20x
4）使用说明书： 1x
【储存】
未开封的试剂盒应储存在4-30℃下，可储存至有效期；一旦打开检测卡包装袋，必须立即进行检测；避免冷冻检测卡缓冲液
【样品收集及处理】
待测标本应采用标准的微生物学方法来获得和处理。
确保样品没有用含有甲醛或其衍生物的溶液进行处理。
【准备工作】
检测前，将试剂盒所有组分和样本（含有待测菌落的培养皿储存在4℃下）平衡至室温（15-30℃），打开检测卡包装袋并取出检测卡，立即进行检测，需标记患者名字或样本编号（一个样本以个检测卡）
样品准备：
关于除细菌菌落以外的样品类型的性能声明尚未建立。我们建议使用新鲜的菌落来获得最佳的测试性能。
1）准备一支半刚性收集管并加入10滴LY-A缓冲液
2）用一次性细菌接种环取1个菌落，并将细菌接种环浸入含有缓冲液的收集管底部，以收集细菌
3）在取出细菌接种环之前彻底搅拌混匀
4）插入滴管并涡旋均质化
5）缓慢滴加3滴稀释后的样本至检测卡样本孔中，或者用微量移液器吸取100μL加入样本孔中
6）等待反应15分钟后读取结果
阴性结果：检测卡阅读框中的质控线（C）出现一条红紫色的线，无其他线出现
阳性结果：质控线出现一条红紫色的线（C），检测区出现一条红紫色的线（48、163或KPC），检测线的强度可能根据抗原的数量以及样本中存在的变异类型而变化。任何红紫色的检测线出现（48、163或KPC），即使是微弱的，也应被认为是阳性结果。
若阳性线只有KPC线，则样本中含有KPC变体；若阳性线只有163线，则样本中含有OXA-163变体（或者密切相关的OXA-247、405、438）；若阳性线只有48线，则样本中存在OXA-48（或者不包括OXA-163亚族的密切相关的变体，如OXA-163、247、405或438）。
在OXA-48检测线为强阳性的情况下，OXA-163检测线可能会出现微弱的信号，这时候应判定结果为OXA-48阳性，OXA-163阴性。
可能发生阳性线的组合，在这种情况下，样品中包含了几种碳青霉烯酶的组合。
无效结果：没有质控线出现，表示试验失败，应使用新的检测卡重新检测
注意：在干燥过程中，在检测线的位置可能会出现一个非常微弱的阴影，它不应该被视为一个阳性的结果。
【性能】
检测限
用纯化的OXA-48和OXA-163重组蛋白测定的检测限分别为0.125 ng/ml、0.49 ng/ml，KPC的检测限为0.625 ng/ml
95%置信区间
灵敏性：100%（68.4 - 100%）
特异性：100%（98.2 - 100%）
阳性预期值：100%（68.4 - 100%）
阴性预期值：100%（98.2 - 100%）
一致性：100%（173/173）
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