骨桥蛋白N-端小鼠试剂盒的实验操作步骤
准备
1) 洗涤液的准备
试剂盒的洗涤液是一种40倍浓缩液,应稀释为1X洗涤液进行洗板用。如用1950 mL稀释50 mL的浓缩洗涤液,制成2000mL即用稀释洗涤液.
2）酶标记抗体的准备
试剂盒中的标记抗体是一种30倍浓缩物,根据所需量用标记抗体稀释液稀释.
2) 标准品的准备
加0.5 mL的去离子水到瓶装标准品中充分溶解,制成,3200pmol/L的标准品液，标准品溶液可冻存，但应避免反复冻融。
3) 标准品的稀释
准备7支试管,并每支各加230 μL EIA缓冲液.
将3200pg/ml的标准品230ul加入到试管-1中混匀，制成1600pg/ml的标准品，再取1600pg/ml的标准品230ul到试管-2中混匀，制成800pg/ml的标准品，以此类推，做2倍倍比稀释，制成1600—25pmol/L的标准品系列。步骤如下图所示:
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4) 样品稀释
应用试剂盒中的“4， EIA缓冲液”按下列要求进行检测样本的稀释，
小鼠EDTA-血浆：2-8倍
小鼠尿液：200-400倍
实验步骤
使用前，将所有试剂应平衡至室温，大约30min，充分混匀，确保试剂质量无改变，标准曲线和样品检测必须同时进行.
1) 确定空白孔，并加入100ulEIA缓冲液。
2) 确定样本孔和标准品孔，并将样本和标准品100ul分别加入相应的孔中
3) 盖板，37℃孵育60min，作为第一次反应，
4) 洗板，倒去孔内反应液,按要求加入预先准备好的洗涤液(每孔不少于350ul)，,再弃去废液.重复洗板4次.在吸水纸上拍干,去除残留液滴.
5) 准备标记抗体，并将每孔中加入100ul 准备好的标记抗体
6) 盖板2-8℃孵育30min作为第二次反应
7) 洗板，倒去孔内反应液,按要求加入预先准备好的洗涤液(每孔不少于350ul)，,再弃去废液.重复洗板5次.在吸水纸上拍干,去除残留液滴.
8) 每孔加入100ulTMB溶液
9) 黑暗中室温孵育30min
10) 每孔加入100ul 终止液终止反应
11) 读取OD值：将板底污物清除，并保证板孔内无气泡，以空白孔为对照进行标准品和样本的测量。测量在450nm处进行，参考波长600-650nm。
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