免疫学综述3-临床常用的抗原或抗体检测方法

由于各种检测方法中所用的抗原性状不同，出现结果的现象也不同。最广泛应用方法有下述几种：

（1） 酶联免疫吸附试验（ELISA） 

酶联免疫检测是目前应用最广泛的免疫检测方法。该方法是将二抗标记上 酶，抗原抗体反应的特异性与酶催化底物的作用结合起来，根据酶作用底物后的 显色颜色变化来判断试验结果，其敏感度可达ng 水平。常见用于标记的酶有辣 根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶（AP）等。由于酶联免疫法无需特殊的仪器， 检测简单，因此被广泛应用于疾病检测。

常用的方法有间接法、夹心法以及BAS －ELISA。间接法是先将待测的蛋白包被在孔板内，然后依次加入一抗、标记了 酶的二抗和底物显色，通过仪器（例如酶标仪）定量检测抗原。这种方法操作简单，但由于高背景而特异性较差。目前已逐渐被夹心法取代。夹心法利用二种一抗对目标抗原进行捕获和固定，在确保灵敏度的同时大大提高了反应的特异性。近年来，抗原的定量检测技术也不断推陈出新。近年来，在夹心法ELISA 的基础上，开发了多抗原检测试剂盒，能同时检测微量液相样本中多个抗原含量。这项技术的应用大大缩短了诊断的时间，提高诊断的可靠性和及时性。
（2）免疫荧光技术

 该法是以荧光素，如异硫氰酸荧光素、罗丹明等标记抗体或抗原，以检测标本中抗原或抗体的方法。免疫荧光技术也包括两种基本类型，即荧光抗体染色和荧光免疫测定。

① 荧光抗体染色：是用荧光抗体浸染可能含有抗原的细胞或组织切片，若有相应抗原存在，则抗原与荧光抗体结合而使荧光素不被洗脱，在荧光显微镜下可见发光的物体，从而达到定位检测目的，在基础与临床医学的研究及疾病的诊断等方面有着广泛用途。根据荧光抗体的不同可分直接法和间接法，前者即用荧光标记的第一抗体直接检测标本片上的抗原，如病毒及某些蛋白质成分等；后者则在未标记的相应抗体(第一抗体)处理标本片后，覆以荧光标记的抗球蛋白抗体(第二抗体)，借此可检测多种抗原与抗体。与直接法相比，间接法仅需标记一种第二抗体即可适应多种抗原抗体系统的检测，且敏感性较高。

②  荧光免疫测定：本法与酶免疫测定一样，可分均相和非均相法。均相法常利用荧光的某些特性，如荧光的激发、吸收、猝灭等设计试验，无需作结合的与游离的标记物分离。双标记法即为均相荧光免疫测定的一种类型，检测试剂为FITC标记的抗原和罗丹明标记的抗体，当两种标记物标记的抗原和抗体特异性结合后使两种荧光素靠近，由于FITC的发射光谱能被罗丹明吸收，从而使FITC的荧光明显减弱。试验时将可能含有抗原的标本与两种标记物一起反应，则能与FITC标记的抗原竞争结合罗丹明标记的抗体，从而减少罗丹明对FITC发射光谱的吸收。通过FITC荧光测定可推算出标本中抗原的量，其与荧光强度成正比。非均相法限于实验室条件、试剂和容器或载体的非特异性荧光干扰等，应用不及ELISA广泛。近年建立的时间分辨荧光免疫测定有很大改进，该法利用稀土金属(铕、铽等)的螯合物具有特长的荧光寿命，将其标记抗体并延长测定时间，以使短命的非特异性荧光衰退，从而测得均一的长寿命稀土螯合物荧光。稀土螯合物的激发光吸收峰(340nm)与荧光发射峰(613nm)之间的差别显著，也利于排除非特异荧光的干扰。目前已用于IgE等微量血清成分及激素和某些药物水平的测定。
 （3）沉淀反应
    可溶性抗原与相应抗体在有适量电解质存在下，出现肉眼可见的沉淀现象，称为沉淀反应。参与反应的抗原称沉淀原，抗体称沉淀素。沉淀原可以是多糖、蛋白质、类脂等，由于其体积小，相对反应面积大，故试验时需对抗原进行稀释，以避免后带现象。应用较早的沉淀反应是环状沉淀反应和絮状沉淀反应，因其敏感性不高，已被淘汰。目前应用最多的沉淀反应是Oudin建立的凝胶(琼脂)沉淀反应及其派生方法。
    ① 单向琼脂扩散 简称单扩，将特异性抗体与熔化的琼脂混合均匀，使抗体均匀分布于琼脂，然后浇制成琼脂板，再按一定要求打孔并加入抗原，使抗原向孔周自由扩散，与板中的抗体形成沉淀圈。本法为定量试验，沉淀圈的直径与抗原浓度成正比。单扩常用于血清中免疫球蛋白、AFP等的定量测定。
    ② 火箭电泳 若在单向琼脂扩散基础上，加入抗原后，将琼脂板置电场中，使抗原置于负极即向正极定向扩散，在与板中的抗体结合而形成锥形沉淀峰，形似火箭，故名火箭电泳。沉淀峰的高度与抗原浓度成正比。由于在电场作用下，促使带负电荷多的抗原泳动，故火箭电泳需时短，可用于快速测定抗原含量，如在标本中加入少量同位素标记的抗原后，可作放射免疫自显影，能检出微量抗原。应用范围与单扩相似。
    ③ 双向琼脂扩散   简称双扩，先制备琼脂板，再按要求打孔并分别加入抗原和抗体，使两者同时在琼脂板上扩散，若两者对应且比例合适，则在抗原和抗体两孔之间形成白色沉淀线。一对相应的抗原抗体只形成一条沉淀线，因此可根据沉淀线的数目推断待测抗原液中有多少种抗原成分；根据沉淀线的吻合、相切或交叉形状，可鉴定两种抗原是完全相同、部分相同还是完全不同。

④ 对流免疫电泳  若在双扩基础上加电泳，将抗原孔置负极端，抗体孔置正极端。由于抗原所带的负电荷较抗体多，且抗原分子小于抗体，在电场中能够克服电渗的作用而由负极泳向正极；抗体却克服不了电渗作用，从正极向负极移动，二者形成对流，并在比例适宜处形成白色沉淀线，称为对流电泳。因抗原抗体皆作定向运动，所以敏感性较双扩为高。
    除上述方法外还有多种免疫沉淀分析技术，如区带电泳和双扩相结合的免疫电泳、区带电泳与火箭电泳联用的交叉免疫电泳，及免疫选择电泳、免疫固定电泳等，分别应用于复杂抗原成分的分析和骨髓瘤、冷球蛋白血症等临床疾病的辅助诊断。随着精密仪器的研制成功，最近又建立了散射比浊、速率散射比浊等方法，使沉淀反应技术更加敏感、精确和自动化。

（4） 凝集反应

细菌、红细胞或表面带有抗原的乳胶颗粒等都是不溶性的颗粒抗原，当与相应抗体结合，抗原与抗体结合形成凝集团块，即称为凝集反应。

直接凝集  是将细菌或红细胞与相应抗体结合产生的细菌凝集或红细胞凝集现象。可用于传染病诊断如肥达氏反应（Widal reaction）诊断伤寒病。或利用血细胞凝集现象检查血型。

间接凝集  是用可溶性抗原包被在乳胶颗粒或红细胞表面，与相应抗体混合出现的凝集现象。如用γ球蛋白包乳胶颗粒检测类风湿关节炎病人血清中的类风湿因子，用甲状腺球蛋白包被乳胶颗粒用于检测甲状腺球蛋的抗体。故凝集反应即可测定抗原，也可测抗体，方法简便、敏感。

小结和展望

综上所述，随着生物医学的发展，各种免疫学检测手段日趋丰富，多种免疫检测方法联合正在成为新趋势。但是目前许多检测方法仍具有一定局限性，精确的、可靠的、快速的及低廉的检测手段仍需探索设计。另外，一些免疫学检测有待于临床大规模试验验证，才能不断地改良、完善。尽管免疫学检测在发展过程中仍面临挑战，但随着免疫学机制的研究、生物学的发展和临床调查的深入，免疫学检测对各种疾病的早诊断、早干预、早治疗都具有重要意义。总的来说，疫学检测的研究意义深远的，同时有待于科学家发现更加有效的检测方法。