一代毛细管电泳测序

实验概述：
一代测序技术是20世纪70年代中期由Fred Sanger及其同事首先发明。
应用领域：
1.DNA测序:从头测序,靶向 DNA 测序,下一代测序验证,HLA 测序,微生物测序,线粒体测序
2. 研究领域:癌症研究,遗传疾病研究,病原体检测与分析,人类身份鉴定,HLA 分型,食品检验等
3. 其他应用:基因表达分析,甲基化分析

在线咨询

咨询热线

400-9600529

实验原理

实验原理：
聚丙烯酰胺凝胶电泳能够把长度只差一个核苷酸的单链DNA分子区分开来。一代测序实验的起始材料是均一的单链DNA分子。第一步是短寡聚核苷酸在每个分子的相同位置上退火，然后该寡聚核苷酸就充当引物来合成与模板互补的新的DNA链。用双脱氧核苷酸作为链终止试剂（双脱氧核苷酸在脱氧核糖上没有聚合酶延伸链所需要的3－OH基团，所以可被用作链终止试剂）通过聚合酶的引物延伸产生一系列大小不同的分子后再进行分离的方法。测序引物与单链DNA模板分子结合后，DNA聚合酶用dNTP延伸引物。延伸反应分四组进行，每一组分别用四种ddNTP（双脱氧核苷酸）中的一种来进行终止，再用PAGE分析四组样品。从得到的PAGE胶上可以读出我们需要的序列。

实验操作指引

  1. DNA碎片化：
  首先要将提取得到的样品完整DNA打碎，形成DNA片段，如只是测定单个目的基因的序列，则无需进行DNA碎片化。
  2. PCR扩增和体外克隆：
  针对特定目的核酸片段的测序，首先要对目的测序区域进行PCR扩增；而针对碎片化DNA的测序，则要将碎片化的DNA片段通过克隆的方式连接到质粒载体中；对于部分PCR产物的测序也可以对其进行克隆，以保证测序样品的纯度和浓度。
  3. ddNTP法循环测序：
  向得到的待测样品中分别加入4种dNTP和4种ddNTP，从而得到不同位置匹配终止的序列。
  4. 凝胶电泳获得序列：
  对得到的序列进行凝胶电泳，根据碱基的顺序和位置确定序列信息。